可用于制造墨水和色淀及生物、细菌组织的染色等方面。 [1]与ZnCl2制成复盐，可用于棉、麻、蚕丝织物、纸张的染色和竹、木的着色。 [1]还它可与结晶紫 和黄糊精 以78：13：9的比例拼混成碱性品蓝。

亚甲蓝因为有还原性，其注射液被用来 正铁血红蛋白血症 。也用于抢救硝基苯 、亚硝酸盐 和氰化物 等。对于一氧化碳轻微者可注射亚甲基蓝进行。临床用于 磺胺。 [1]

因为其杀菌消毒的作用，口服亚甲蓝或用其溶液冲洗可以 和 。另外，亚甲蓝在进入人体30分钟（注射）至几小时（口服）内会从尿中排出，导致尿液暂时呈蓝色，因此也用来作肾功能测定。

观赏鱼养殖中，0.1-0.2ppm的亚甲蓝溶液也被用作消毒，或 白点病 等疾病。

在化学实验中，分析纯亚甲基蓝可用作化学试剂中的吸附指示剂，也可用以沉淀高氯酸盐和铼酸盐，催化光度测定硒和钼等。

同时，亚甲蓝还具有氧化性，可以氧化一些还原性较强的物质，自身被还原成无色的还原态亚甲蓝（有人称亚甲基白）。在被还原后，还原态的亚甲蓝便具有一定的还原性，可以被一些氧化性物质，如空气中的氧氧化，又生成氧化态的蓝色亚甲蓝。因此亚甲蓝可用于氧化-还原滴定，也可用来示范氧化-还原振荡反应，最典型的是蓝瓶子实验 。